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                      Oligo DNA合成

                      2015-2-11 15:20:20      點擊:

                      固相亞磷酰胺三酯法是目前最常用的OligoDNA化學合成方法,它具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。 

                      合成步驟:

                      1、脫保護:

                      將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應,脫去其5′-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5′-羥基;

                       2、縮  合:

                      合成DNA的原料-單體,與活化劑四氮唑混合,得到核苷亞磷酸活化中間體,它的3′端被活化, 5′-羥基仍然被DMT保護,與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應; 

                      3、帶帽 (capping)反應:

                      縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應 (少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應; 

                      4、氧 化:

                      在氧化劑碘的作用下,亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯; 通過上述步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再重復以上步驟,直到所有要求合成的堿基被連接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率;

                       5、氨 解:

                      通過氨水高溫處理,連接在CPG上的引物被切下來; 

                      6、純  化:

                      切下來的Oligo粗品根據實驗目的不同選擇不同的純化手段進行純化, OD260定量及抽干后根據定單要求對Oligo進行分裝。



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